前面我們已經摘要介紹了該文章，受到氫粉的熱讀，這裡將全文介紹給大家，希望能加深理解。長期喝氫水預防膽管癌【實驗】
氫氣作為一種健康促進工具，理論上最重要的是提高健康水平，延緩慢性病發生，預防和推遲惡性癌症發生。在癌症預防方面，2010年日本學者有預防原發性肝癌的研究。這次有於教授預防膽管癌的研究，過去也有關於膀胱癌和結腸癌的相關研究。這個方向仍然值得大家進一步探索，這將給氫氣醫學應用提供重要的理論支持。氫思語注，最近發現一些公眾號轉發本號文章是故意不注明出處，所謂來自網絡，來源不詳的說法，肯定是站不住腳。要麼不要轉，要轉就注明出處。
介紹中國的癌症發病率和死亡率一直在快速上升。中國流行癌症，如肝癌、胃癌、食道癌、鼻咽癌和宮頸癌的發病率仍然很高，一些與不健康的生活方式和環境污染有關的癌症，如肺癌、乳腺癌、結腸癌和前列腺癌，在過去十年中急劇增加(Chen et al.， 2016)。這種增長最普遍接受的原因是迅速的工業化和城市化伴隨著生活方式和環境的急劇變化。對財富的過度追求導致不可逆轉的環境快速惡化，這與癌症發病率和死亡率的增加相關。「癌症村」的存在為癌症發病率與環境致癌物之間的因果關係提供了證據(Lu et al.， 2015)。雖然政府正在大力扭轉環境污染可從根本上解決部分問題。但是仍然需要一種「預防」癌症發生的替代策略。
化學藥物預防是指使用天然、合成或生物制劑來避免、延遲、逆轉或抑制癌症的起始和進展(Walczak et al.， 2017)。理想的化學預防劑是可以在不產生嚴重副作用的情況下，對患癌症的高危人群長期使用。在觀察性研究和臨床試驗中，阿司匹林、二甲雙胍和他莫西芬等藥物可以降低癌症發病率，且副作用有限。長期服用阿司匹林可以降低癌症的發病率和死亡率，特別是在大腸癌和膽管癌。最近的一項臨床試驗表明，低劑量二甲雙胍可以降低息肉切除術後異時性腺瘤和息肉的患病率和數量。然而，阿司匹林(胃腸道出血)和二甲雙胍(胃腸道紊亂)的有害影響是潛在的副作用，在標準治療方案中仍然可能無法接受，甚至在標籤外用於癌症預防中也無法接受。
這項研究旨在探索一種更安全、更自然、更容易接受的替代物質實現預防癌症的目的。氫氣具有作為一種「新型」抗氧化劑在預防和治療方面應用的潛力(Ohta, 2011)。2007年《自然醫學》雜誌報道了氫氣對腦梗死模型大鼠的積極治療作用(Ohsawa et al.， 2007)。此外，大量研究已經在廣泛疾病模型、人類疾病和治療相關病理中探索了氫氣的治療效果(Ichihara et al.， 2015)。這些疾病大多與氧化應激相關疾病和炎症性疾病有關。
氫氣的抗腫瘤作用研究由來已久。1975年，Dole等人在《科學》雜誌上首次報道了一種含有97.5%氫氣的溶液可以減少裸鼠鱗狀細胞癌的生長。最近的研究表明，氫可以抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤血管生成，同時減少放療和化療的副作用。這些數據支持氫氣在人類實體癌症中的化學預防和治療潛力。在前期研究中，我們已經證明，長期使用氫水可以降低42.9%的硫代乙酰胺誘導大鼠膽管纖維化。在這裡，我們使用人工智能算法對這些樣本進一步的研究，並探索了其可能的機制。
二、實驗方法
2.1 動物模型所有實驗程序均由中國上海同濟大學附屬東方醫院實驗動物倫理委員會批准。本研究共進行了三個實驗。第一項研究招募了20只 SD大鼠，將它們分為兩組:每天飲用普通水和氫水。這些大鼠未被給予硫代乙酰胺。本實驗用於確定長期使用富氫水的安全性以及富氫水是否能改善生活質量(補充圖S1)。 第二組選取38只成年雄性SD大鼠(300-370 g)，分別給予含或不含富氫水的硫代乙酰胺 5個月。將大鼠分為硫代乙酰胺組(n = 19)和硫代乙酰胺 +氫氣組(n = 19)。所有大鼠每天在其飲用水中給予300 mg/L的硫代乙酰胺，直到處死。此外，試驗組每日口服1.8 mg/L富氫水2ml，對照組常規水2ml。治療8周後，每組每月處死3只動物，取肝臟檢測硫代乙酰胺的致瘤作用和氫氣的預防作用。動物每周稱重。 第三組招募30只成年雄性SD大鼠。各組大鼠灌服相同的硫代乙酰胺水3個月後停止飲水，分為普通水組和富氫水組。本實驗用於檢測富氫水是否能阻斷CCA的進展。
2.2 肝臟的採集程序和組織病理學評價在指定的時間，以CO2流量(每分鐘籠子體積的10-30%)處死所有動物。在中線剖腹手術後，評估所有肝葉的疾病，然後切除。仔細檢查肝臟的大體形態並進行評分。測定肝臟表面病變的數量。下腔靜脈採血，檢測肝功能和其他生理指標。用水洗肝，切成3- 5mm的切片;每個肝臟樣本的一半保存在−80°C，另一半固定在4%多聚甲醛中。統計各組織切片的病變數量。 為了客觀、定量地評估病變，我們開發了一種基於卷積神經網絡(CNNs)的自動病變檢測框架，用於肝臟病變的檢測。首先使用Otsu閾值算法從整個圖像(WSIs)中提取組織區域，然後進行形態學運算，計算相應的組織面積Atissue。隨後，提出了基於深度學習的病變自動檢測框架，從組織區域檢測和定位纖維化和癌症區域。該框架由斑塊級分類和後處理過程組成，用於生成WSI的病變似然圖。我們以滑動窗口的方式在組織區域運行局部CNN分類器。對於每個斑塊，使用分類器給出病變概率。然後對概率進行累積，得到WSI的可能性圖。然後，對似然圖進行歸一化，使每個像素都有一個從0到1的連續似然。為了獲得病變區域Alesion，似然圖的閾值為0.9，以去除低似然區域。已知WSI的整個組織面積(Atissue)和病變面積(Alesion)，可以計算比值= Alesion/Atissue。
2.3 RNA-Seq對上海大江生物技術有限公司第一次實驗中僅給予硫代乙酰胺的4只大鼠和給予硫代乙酰胺 +氫氣的4只大鼠，使用正常的肌肉或腸道組織以及有病變的肝臟進行測序和分析。
2.4免疫組織化學取第一次實驗大鼠皮膚和第二次實驗大鼠肝臟，用中性緩衝福爾馬林固定，石蠟包埋。
2.5採用高通量測序法分析第二次實驗大鼠腸道菌群在使用TopTaq DNA聚合酶試劑盒(Transgen，中國)進行DNA分離之前，從第二次實驗的大鼠結腸中收集糞便樣本，置於−80°C保存。
2.6數據預處理與分析所有數據集均為來自腸道微生物群落的16S rRNA基因擴增子測序數據，首先從原始數據中刪除低質量reads (Q < 20)。然後使用USEARCH去除非特異性擴增子、錯誤率為>2的reads、單例序列和嵌合序列，以獲得乾淨的數據。合格序列以與UPARSE 97%的相似性聚類成操作分類單元(OTUs) (Edgar, 2013)。利用核糖體數據庫項目(RDP)對OTUs的代表性序列進行分類。我們使用軟件包計算了α-和β-多樣性R。我們使用Bray – Curtis非相似性指數和UPGMA連鎖法進行聚類分析。採用典型對應分析(CCA)分析dicqa對微生物組成的貢獻。採用線性判別分析效應分析各組微生物群落的差異。
2.7統計數據所有統計分析均採用SPSS和GraphPad Prism(5.0版)軟件進行。分類資料採用χ2檢驗進行分析。兩組間的差異用雙尾t檢驗確定。三組之間的比較應採用方差分析和事後檢驗進行評估。P值小於0.05被認為具有統計學意義。
三、結果
3.1長期使用氫水的安全性和生活質量影響。在所有實驗中沒有硫代乙酰胺或藥物相關死亡率的實例。第一個實驗主要集中在富氫水使用的安全性。與對照組相比，使用氫水9個月未引起包括心臟、肝臟和腎臟在內的內臟器官的任何病理改變(圖1A)。兩組間AST和ALT水平無顯著差異(圖1B)。然而，在此期間，我們觀察到兩件令人興奮的事情:飲用富氫水的大鼠的毛髮比不飲用富氫水的大鼠的毛髮更白、更有光澤(圖1C);前者的精子活力高於後者(圖1D)。此外，HE和IHC染色顯示，前者大鼠比後者大鼠的毛囊更致密，增殖活性更高(圖1C)。
圖1.長期使用富氫水的安全性及其對大鼠生活質量的影響。
3.2富氫水抑制硫代乙酰胺誘導的膽管纖維化形成。肝臟的連續採集如圖2A所示。將肝臟表面和各肝臟切片上的腫瘤結節進行徹底計數並製成表格(圖2B)。硫代乙酰胺組大鼠(9/9,100%)和硫代乙酰胺 +氫氣組大鼠(28.6%，2/7)均出現可見的肝臟白色結節。總的來說，硫代乙酰胺組肉眼可見白色結節的平均數目為7.4±5.7，明顯高於硫代乙酰胺 +氫氣組(1.3±2.6)。
圖2.各組20周時肝內病變的發生率。(A)分別於8、12、16、20周處死3只大鼠(硫代乙酰胺和硫代乙酰胺 +氫氣)。(B)肝表面及肝內白色結節計數。(C)基於卷積神經網絡(CNNs)開發了自動組織學分類來評估肝臟病變。兩組肝臟切片具有代表性的全片圖像(H&E:上部;人工智能:低)。人工智能,人工智能。(D) AI算法評估兩組肝臟病變的比例。€光鏡下計數兩組顯微鏡下膽管纖維化數。
肝臟病變最明顯和最重要的特徵如下:纖維化(以α-SMA表達為特徵)(補充圖S2A,E)和膽管纖維化(以CK7和CK19過表達為特徵)(補充圖S2B-D)。在這裡，我們開發了一個基於深度學習卷積神經網絡(cnn)的自動病變檢測框架。該人工智能算法清晰地顯示了WSIs中肝臟病變的位置和數量(紅色)(圖2C)。硫代乙酰胺組AI識別的纖維化病變比例為19.6%±9.01，明顯高於硫代乙酰胺 +氫氣組(7.53%±11.0)(圖2D)。我們還在光學顯微鏡下計算了顯微「腸道型」CCAs。硫代乙酰胺組所有大鼠(100%，9/9)均出現鏡下膽管纖維化，鏡下平均12±10.1只大鼠。值得注意的是，在硫代乙酰胺 +氫氣組中，只有57.1%(4/7)的大鼠發生了顯微鏡下的膽管纖維化，每只大鼠的病變率為2.9±5.4個，而其他42.9%的大鼠沒有任何可檢測到的膽管纖維化。硫代乙酰胺組的膽管纖維化發生率明顯高於硫代乙酰胺 +氫氣組(p = 0.0487)(圖2E)。這些數據提供了第一手證據，富氫水可以抑制膽管纖維化的發展。
3.3 氫水可防止硫代乙酰胺誘導的纖維化和膽管纖維化的進展。順序觀察發現，硫代乙酰胺組肝臟形態在12周時開始惡化，在16周和20周時顯著惡化。在硫代乙酰胺 +氫氣組中，肝臟形態在16周時開始惡化，只有28.6%(2/7)的病例在20周時出現惡化(圖3A,B)。
圖3.使用或不使用富氫水誘導硫代乙酰胺時肝臟病變的顯微鏡圖。(A)指定時間點肝臟的代表性大體圖像。(B)補充或不補充富氫水的硫代乙酰胺治療肝臟狀態示意圖。(C)人工智能算法分析的指定時間點肝臟膽管病變的代表性圖像。(D) AI算法在指定時間點的代表性玻片上評估肝臟膽管病變的比例。
我們通過人工智能算法分析了在富氫水處理存在或不存在的情況下，硫代乙酰胺誘導產生的顯微鏡下肝臟病變。硫代乙酰胺組肝臟病變比例隨時間急劇增加(圖3C上、圖3D左)，而硫代乙酰胺 +氫氣組肝臟病變比例僅在16周時增加，之後降至較低水平(圖3C下、圖3D右)。這些數據進一步證實氫氣治療延緩了纖維化向膽管纖維化的進展。
3.4氫減少糖酵解並阻斷增殖膽管細胞與微環境之間的交互影響。
接下來，我們使用RNA-seq分析，分析當硫代乙酰胺誘導的膽管纖維化用富氫水處理時發生的變化。不出所料，我們觀察到這兩組之間的基因表達譜存在顯著差異(補充圖S3A,B)。氫氣處理顯著影響多個信號通路(補充圖S3C,D)，包括細胞粘附和炎症相關通路的基因。經硫代乙酰胺處理，S100家族的多個成員數量增加，富氫水使這些基因的表達下調了3到5倍(圖4A,B)。進一步分析發現，硫代乙酰胺 +氫氣組ERBB2下調。此外，我們發現糖酵解中的三種限速酶，己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶，在接受富氫水的大鼠中下調了2到4倍(圖4C)。
圖4.RNA-seq分析顯示硫代乙酰胺組和硫代乙酰胺 +氫氣組的肝臟之間存在差異基因表達
3.5氫能阻斷硫代乙酰胺引發的膽管纖維化。雖然氫氣降低了硫代乙酰胺誘導的膽管纖維化模型中膽管纖維化的發生率，但通過對肝臟病變的rna測序分析，氫氣干預並不影響突變比例(圖5A,B)。考慮到某些腫瘤在第一代遷移時的高死亡率可以在下一代中降低，我們模擬了這種情況，在不進行任何干預的情況下餵養SD大鼠3個月後去除硫代乙酰胺(圖5C)。如果不治療，100%的大鼠(7/7)在第6個月出現鏡下膽管纖維化。而給予富氫水6個月後，只有12.5%(1/8)的大鼠出現鏡下膽管纖維化。AI算法還證實，在氫氣干預下，硫代乙酰胺預處理大鼠的ales/ Atissue比例顯著降低(圖5D,E)。
腸道菌群組成
考慮到氫水可以緩解便秘，我們研究了氫氣如何影響腸道菌群的組成。即使在這個小的隊列中，我們也觀察到兩組之間的alphaDiversity有顯著的差異(圖6A)。總的來說，硫代乙酰胺-regular water組腸道菌群的平均數量為1626個，硫代乙酰胺-氫氣組腸道菌群的平均數量為1589個，交集數為1196個(圖6B)。氫氣處理5個月後，不同分類水平的菌株的相對丰度發生顯著。
圖5.長期使用氫水可以阻斷硫代乙酰胺引起的膽管纖維化。
3.6 氫改變腸變化，包括科、屬、目、門和種(圖6C)。聚類分析將所有大鼠清晰地分為不同組(圖6D)。
圖6.氫改變了腸道菌群的組成。
四、討論2012年，癌症死亡率是全球第二大死亡原因，如果不做出改變，最終可能成為頭號死亡原因。由於快速工業化和城市化導致的生活方式選擇的嚴重改變和環境惡化，中國的情況尤其糟糕。「精准醫療」的概念吸引了大量研究投資。然而，對於發展中國家或地區來說，新的癌症藥物治療和分子檢測方法日益增長的費用是難以持續發展的。對於這一潛在健康和經濟災難，最有吸引力的解決方案是「預防」。除了避免風險因素和保持健康的生活方式，預防癌症發生的化合物可以提供一個有效的預防方法來降低癌症風險。然而，用於癌症預防的研究資金佔所有癌症研究資金的比例不到3% (Albini等人，2016)，這一數字在發展中國家甚至更低。這些資金不足以開發毒性最小的有效癌症預防藥物。現有的藥物，如阿司匹林、二甲雙胍和他莫西芬，可能是有用的替代品。最近，40歲至69歲之間有正常出血風險的個體被證明受益於每天服用阿司匹林，用於心血管疾病和結直腸癌的一級預防(Dehmer et al.， 2015)。然而，胃腸道(GI)和腦出血風險的增加使得在某些情況下預防性使用阿司匹林是不可接受的。在這裡，我們證明瞭分子氫是一種有效和安全的癌症預防方式。
膽管癌(CCA)是一種實體瘤病變，由多種上皮腫瘤組成，伴有晚期診斷和不良預後。膽管纖維化是一種有爭議的肝內膽管病變，存在增生性、化生和炎症成分，在化學誘導的大鼠模型中，膽管纖維化先於膽管癌的發展。在嚙齒類動物模型中，膽管上皮表現出獨特的形態特徵，包括由嗜鹼性高的化生上皮(腸上皮化生)組成的擴張腺體，如先前所提出的被稱為「腸型膽管癌」。該模型是理想的試驗療效的膽管纖維化腫瘤開始前。在對該模型進行了5個月的氫分子治療後，我們從兩個方面評估了這些治療的預防效果:我們開發的人工智能算法識別的肝臟病變和顯微鏡下的膽管纖維化。正如預期的那樣，接受富氫水治療的大鼠肝臟病變的比例比未接受治療的大鼠要好得多。此外，我們發現，富氫水處理後，可見和顯微鏡下肝纖維化的數量減少。總的來說，這些數據證實了富氫水在預防癌發生作用。重要的是，我們沒有觀察到長期使用氫水的任何副作用。是否飲用氫水可以用於預防高危人群的癌症還需要進一步的研究。
一些研究提出，分子氫作為一種抗氧化劑猝滅活性氧(ROS)。隨後的研究表明，氫分子可以抑制炎症中的多個信號通路和下游靶點。氫還可以改變信號分子的活性和表達水平，包括NF-kB p65或NF-kB、STAT3、GSK-3ß、JNK、Ras、ERK和JNK。在我們的研究中，我們發現氫可以抑制ERBB2過表達，而ERBB2過表達是加速CCA腫瘤發生的驅動因素。癌症細胞的一個獨特特徵是通過糖酵解產生能量和合成代謝，同時高水平的限速酶催化糖酵解的第一步(HK)、中間(PFK)和最後一步(PKM)。氫具有減弱這一代謝過程的能力，表明它可能通過調節糖酵解抑制腫瘤的發生。膽管癌的特點是炎性細胞浸潤和腫瘤間質不受控制的增生。我們的分析表明，當長期飲用氫水時，S100家族成員(S100A4、−6、−8、−9、−10和−11)的表達水平顯著降低。S100蛋白促進增殖細胞和基質細胞之間的通信，包括成纖維細胞、內皮細胞和炎症細胞(腫瘤相關巨噬細胞、骨髓源性抑制細胞、T淋巴細胞和中性粒細胞)。長期使用富含氫的水似乎會破壞這種癌-間質相互作用。
癌症攔截作用包括早期階段癌症發展過程的中斷，以減緩甚至逆轉轉化病灶腫瘤塊的生長(Albini等，2016)。我們的研究中，旨在進一步評估分子氫在減少癌症進展中的攔截策略。為了測試這個問題，我們已經首先用硫代乙酰胺對大鼠進行了三個月的處理，然後再用氫水對大鼠進行治療。最後的結果表明是有效的。當給予氫水時，沒有大鼠發生膽管纖維化，肝臟病變比例顯著降低，說明分子氫有可能中斷癌症的發展過程。這一結果為那些已經暴露於污染物一段時間再使用氫水預防癌症人提供了一個潛在解決策略。
腸道菌群和癌症發生等慢性炎症相關疾病有密切關係，氫水對便秘有一定緩解作用。為了研究為什麼長期使用氫水可以緩解便秘和預防癌症的發生，我們對硫代乙酰胺預處理的大鼠的糞便樣本進行了全基因組鳥槍測序，這些大鼠的糞便樣本有或沒有隨後的氫水干預。氫確實導致腸道菌群組成的顯著變化。氫的使用降低了clostridiaceae_1的丰度，這與抗生素治療引起的炎症相關(Unno et al.， 2015)。以將多糖發酵成短鏈脂肪酸而聞名的瘤胃球菌減少了，而與肥胖狀態下炎症升高相關的Turicibacter通過氫的使用增加了(Jiao et al.， 2018b)。科里桿菌科的成員被認為是健康胃腸道微生物群的指標(Krogius-Kurikka等人，2009)。氫可以上調放線菌的丰度，這在許多病理條件下顯示了有益的作用(Binda等，2018)。我們的發現支持了這樣一種觀點，即改變的腸道微生物群介導了氫對中斷腫瘤進展和改善生活質量的影響。目前尚不清楚這些腸道微生物群的變化是否與宿主的生理功能有關，需要進一步研究以瞭解每個改變的分類單元在維持體內平衡中的作用。
總之，我們的數據首次表明，長期使用氫水可以防止肝損傷，並顯著降低化學誘導的膽管纖維化的發病率。富氫水可改善大鼠的生活質量。這些結果表明，長期使用富氫水是安全有效的。氫消耗顯著降低了糖酵解和S100家族關鍵蛋白的mRNA水平，這可能與分子氫抗氧化活性有關。我們的結果還表明，在膽管纖維化的起始階段，氫的使用抑制了潛在的致病菌。但是，我們的研究結果都是描述性的證據，不能揭示氫氣的直接機制和直接靶向器官。需要更多的研究來確定氫依賴在癌症預防中的潛在機制，並探索其潛在的臨床價值。
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