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重點整理：

『1.有研究表明富氫水可顯著抑制放療引起的氧化應激反應，減輕放療的不良反應，有效改善接受放療的肝癌患者的生活質量，提示富氫水可輔助用於惡性腫瘤患者的放化療。

2.實驗證明富氫水可減輕化學毒性物質所致的大鼠腎臟損傷，並抑制早期腫瘤的發生。我們前期在動物實驗中發現，富氫水對葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導的慢性結直腸炎及結直腸癌具有較好的預防作用，能顯著抑制腫瘤的發生。

3.與飲用普通水的對照組相比，富氫水干預組小鼠整體成瘤情況受到抑制，具體表現為富氫水干預組小鼠的腫瘤體積和質量均低於對照組；第28天時，富氫水干預組小鼠的腫瘤體積為(587±64) mm3，質量為(0.262±0.028)g，均低於對照組[平均腫瘤體積為(892±108) mm3，質量為(0.438±0.034)g；P < 0.01]。

4.富氫水干預組Ki-67蛋白表達陽性細胞率為(11.0±2.8)%，而對照組為(28.0±3.6)%，兩組比較差異有統計學意義(P < 0.05)，說明富氫水干預後小鼠結直腸癌細胞的增殖能力減弱。採用TUNEL法檢測兩組小鼠結腸癌組織的細胞凋亡情況，結果表明，富氫水干預組凋亡細胞率為(14.8±2.2)%，而對照組僅為(2.6±0.4)%，兩組比較差異有統計學意義(P < 0.05)，表明富氫水可促進結腸癌細胞凋亡。

5.與對照組相比，富氫水干預後並未顯著降低小鼠結腸癌細胞內ROS（活性氧物質）的含量，而是通過降低GSH（穀胱甘肽）和升高GSSG（氧化型榖胱甘肽）水平(P < 0.05)發揮抗腫瘤作用。與飲用普通水的對照組相比，富氫水干預組GSH水平降低了22%，而GSSG含量升高了38%，從而顯著提高了GSSG/GSH的比值(P < 0.05)

6.2007年，日本學者採用化學反應、細胞學等手段，證明氫氣溶解在液體中可選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子(兩者皆為氧化損傷的重要介質)[12]。這一發現引起了研究氫氣治療疾病的熱潮，大量研究相繼發現氫在腦組織缺血再灌注損傷[13]、炎症[14]、電離輻射損傷[15]、神經系統損傷以及代謝綜合徵[16-17]等疾病中均發揮一定的作用。

7.研究發現富氫水可減輕組織氧化應激和炎症反應[18-19]。另有少量研究表明，富氫水對腎癌[8]及非酒精性脂肪肝引發的肝癌具有一定的預防作用[20]。本研究利用結腸癌荷瘤小鼠動物模型，研究了富氫水對結腸癌腫瘤細胞增殖、凋亡及氧化應激狀態的影響，結果表明富氫水可有效抑制腫瘤細胞的增殖，抑制腫瘤的生長，誘導腫瘤細胞凋亡，並進一步證明了富氫水抗腫瘤生物學活性的發揮與其對腫瘤組織氧化應激狀態的調節作用有關。

8.本研究發現富氫水干預後，雖然並未降低結腸癌組織細胞內ROS的含量，但可降低GSH水平、升高GSSG水平，提高GSSG/GSH的比值，從而打破細胞內的氧化還原平衡，使腫瘤組織處於ROS應激狀態，這可能是富氫水發揮抗腫瘤活性的機制之一。

研究結果提示富氫水可能通過影響多個靶基因發揮腫瘤的抑制作用。』

氫氣治療癌症最早在1975年就有學者在《科學》雜誌上報導，但該研究是呼吸8個大氣壓氫氣連續14天，和我們一般講的氫氣醫學效應在劑量上相差懸殊。關於氫氣對癌症的治療作用，日本學者有結合納米白金對癌細胞的研究，也有和化療藥物聯合治療癌症的研究。

一直沒有單純用小劑量氫氣或氫水對癌症治療效果的研究報到。最新這一來自上海交通大學的研究可以說是氫氣治療癌症方面的開創性研究，證明飲用氫水能抑制癌症生長。

我認為，氫氣治療癌症這事比較大，需要更多研究機構進一步驗證。動物實驗結果也不等於人類同樣有效。不過確實有許多人希望氫氣真可以具有治療癌症的作用。日本學者太田成男在2007年論文發表後的一次學術報告中，主持人就說氫氣的最重要作用應該是治療癌症。但可惜後來並沒有這方面的研究報導，給這個領域留下了一個懸念。氫氣作為預防癌症的工具價值應該比較大。

建議開展氫氣預防癌症復發的大規模臨床研究

氫氣醫學創始人太田成男教授訪談（視頻）

太田成男教授解釋氫氣效應

富氫水對結直腸癌荷瘤小鼠腫瘤的生長抑制作用及其機制

張瑤, 姜婧, 周海玥, 蔣芮, 李雅婷, 宋立華

摘要: 目的初步探討富氫水（hydrogen-rich water，[H]H2O）對結直腸癌荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用及其機制。方法小鼠右腋皮下接種人結直腸癌SW480細胞（4×106/只），建立移植瘤小鼠模型，造模的同時給予小鼠自由飲用富氫水（0.8 mg/kg），每日早、中、晚3次更換新鮮富氫水。對照組給予普通水。荷瘤28 d後處死小鼠，取腫瘤組織，通過檢測腫瘤體積和質量判斷腫瘤的生長情況。用免疫組化法檢測腫瘤組織中Ki-67蛋白的表達，TUNEL法檢測細胞凋亡情況，比色法檢測谷胱甘肽（GSH）及氧化型谷胱甘肽（GSSG）水平，基因晶片和qRT-PCR方法篩選並驗證差異表達基因。結果與對照組相比，富氫水干預後可抑制小鼠腫瘤的形成，減小腫瘤體積和質量（P < 0.01，P < 0.05），降低Ki-67蛋白的表達（P < 0.05），促進細胞凋亡（P < 0.05），增高GSSG/GSH比值（P < 0.05）；富氫水干預可調節γ-干擾素（IFN-γ）相關基因的表達。結論在結直腸癌中，富氫水可通過抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、調節細胞內氧化還原環境及IFN-γ相關基因的表達而發揮抗腫瘤活性作用。

結直腸癌是常見消化道惡性腫瘤之一，其發病率在全世界範圍內處於惡性腫瘤第3位，在西方已開發國家中處於第2位[1-2]。在我國，隨著近年來居民生活水平的提高和飲食習慣的改變，結直腸癌的發病率也呈上升趨勢，位居惡性腫瘤和致死因素的第4位[3]。結直腸癌早期診斷率低，術後易復發，具有高侵襲性和高病死率的特點，所以從膳食營養干預的角度尋找能有效抑制結直腸癌細胞增殖的功能性物質具有重要意義。

研究發現氫分子具有良好的選擇性抗氧化及抗炎作用[4]。富氫水(hydrogen-rich water，[H]H2O)含有較高濃度的氫氣，目前關於富氫水的研究大多圍繞其良好的抗氧化及抗炎活性，及其在缺血再灌注損傷、糖尿病等代謝性疾病的應用[5-6]，將其應用於腫瘤的預防及治療方面的研究較少。有研究表明富氫水可顯著抑制放療引起的氧化應激反應，減輕放療的不良反應，有效改善接受放療的肝癌患者的生活質量，提示富氫水可輔助用於惡性腫瘤患者的放化療[7]；Li等[8]證明富氫水可減輕化學毒性物質所致的大鼠腎臟損傷，並抑制早期腫瘤的發生。我們前期在動物實驗中發現，富氫水對葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導的慢性結直腸炎及結直腸癌具有較好的預防作用，能顯著抑制腫瘤的發生(未發表數據)。本研究利用皮下接種人結直腸癌細胞系SW480細胞建立荷瘤小鼠動物模型，初步探討富氫水對腫瘤形成、生長的抑制作用及其分子機制。

1 材料和方法

1.1材料

BALB/c雄性裸鼠購於上海斯萊克實驗動物有限公司[動物許可證號：SYXK(滬)2010-0101]，4周齡，體質量(20±2) g；結直腸癌細胞系SW480購於中國科學院上海細胞庫；DMEM培養基購於上海源培生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)購於Gibco公司；鼠抗人Ki-67單克隆抗體工作液及EnVisionTM二抗均購於上海長島生物技術有限公司；TUNEL試劑盒購於瑞士羅氏公司；活性氧(ROS)檢測試劑盒(S0033)、谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測試劑盒(S0053)均購於上海碧雲天生物技術研究所；焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)購自上海索寶生物科技有限公司；TRIzol®試劑購於Life Technologies公司；無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇均為國產優級純，購自上海晶純生化科技股份有限公司；引物由Invitrogen公司合成；螢光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒PrimeScript® RT ReagentKit (Perfect Real Time，RR037A)購於寶生物工程(大連)有限公司；富氫水(0.8 mg/kg, 還原電位500 mV)由北京活力氫源飲品有限公司提供。

1.2實驗動物分組及模型建立

將16隻4周齡的BALB/c雄性裸鼠隨機分為對照組(Ctrl, n=8)和富氫水干預組([H]H2O, n=8)。首先，取對數生長期的SW480細胞，於裸鼠右腋皮下接種(4×106/只)。接種後，為保證水中氫氣濃度，富氫水干預組每天早、中、晚3次更換新鮮富氫水供小鼠自由飲用；對照組給予普通水。觀察腫瘤的生長情況，用直尺測量腫瘤長度(a)、寬度(b)，用公式V=ab2π/6計算其體積。荷瘤28 d後處死小鼠，取腫瘤組織，稱質量後進行後續實驗。

1.3免疫組化檢測Ki-67表達

1.4TUNEL染色檢測細胞凋亡

1.5氧化應激相關指標的檢測

1.6差異表達基因檢測

1.7qRT-PCR方法驗證部分基因的表達

1.8統計學處理

2 結果

2.1 富氫水對荷瘤小鼠腫瘤體積和質量的影響

與飲用普通水的對照組相比，富氫水干預組小鼠整體成瘤情況受到抑制(圖 1A、1B)，具體表現為富氫水干預組小鼠的腫瘤體積和質量均低於對照組(圖 1C、1D; P < 0.01, P <0.05)；第28天時，富氫水干預組小鼠的腫瘤體積為(587±64) mm3，質量為(0.262±0.028)g，均低於對照組[平均腫瘤體積為(892±108) mm3，質量為(0.438±0.034)g；P < 0.01]。

圖 1 富氫水對裸鼠體內成瘤能力的影響

Fig1 Inhibitory effects of hydrogen-rich water on the growth of tumor in nude mice

2.2富氫水對荷瘤小鼠結直腸癌組織中Ki-67蛋白表達及細胞凋亡的影響

富氫水干預組Ki-67蛋白表達陽性細胞率為(11.0±2.8)%，而對照組為(28.0±3.6)%，兩組比較差異有統計學意義(P < 0.05)，說明富氫水干預後小鼠結直腸癌細胞的增殖能力減弱。採用TUNEL法檢測兩組小鼠結腸癌組織的細胞凋亡情況，結果表明，富氫水干預組凋亡細胞率為(14.8±2.2)%，而對照組僅為(2.6±0.4)%，兩組比較差異有統計學意義(P < 0.05)，表明富氫水可促進結腸癌細胞凋亡，見圖 2。

圖 2 富氫水對荷瘤小鼠結腸癌組織Ki-67蛋白表達及細胞凋亡的影響

Fig2 Expression of Ki-67 protein and the apoptosis in colon tumor tissues of[H]H2O and Ctrl groups

2.3富氫水對荷瘤小鼠結直腸癌組織氧化應激狀態的影響

如圖 3所示，與對照組相比，富氫水干預後並未顯著降低小鼠結腸癌細胞內ROS的含量，而是通過降低GSH和升高GSSG水平(P < 0.05)發揮抗腫瘤作用。與飲用普通水的對照組相比，富氫水干預組GSH水平降低了22%，而GSSG含量升高了38%，從而顯著提高了GSSG/GSH的比值(P < 0.05)。

圖 3 富氫水對荷瘤小鼠結腸癌組織氧化應激狀態的影響

Fig3 Effects of hydrogen-rich water on oxidative stress in tumor bearing mice

2.4富氫水對荷瘤小鼠結直腸癌組織部分基因表達的影響

為了進一步探究富氫水抑制結腸癌細胞增殖、促進其凋亡的分子機制，本研究利用基因晶片對比了富氫水干預組與飲用普通水的對照組小鼠腫瘤組織的差異表達基因(圖 4A、4B)，其差異表達基因的驗證結果如圖 4C所示。從圖中可以看出，與對照組相比，富氫水干預可上調Mmp9、II12rb1、Csf2rb、Tnfaip8l2、Cxcl9(P < 0.05)，下調Cdk6、Nrp2及Cldn24等γ-干擾素相關基因(P < 0.05)。

圖 4 富氫水對荷瘤小鼠結直腸癌組織部分基因表達的影響

Fig4 Effects of hydrogen-rich water on gene expression profiles in colon tumortissues of [H]H2O and Ctrl groups

3 討論

早在1975年，Dole等[11]將患有鱗狀細胞癌的無毛小白鼠放於高壓氫氣艙內(8 MPa，2.5％氧氣，97.5％氫氣)，發現氫氣可使皮膚腫瘤消退。但由於高壓氫氣用於臨床治療存在安全隱患，此類研究並未引起廣泛注意。直至2007年，日本學者採用化學反應、細胞學等手段，證明氫氣溶解在液體中可選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子(兩者皆為氧化損傷的重要介質)[12]。這一發現引起了研究氫氣治療疾病的熱潮，大量研究相繼發現氫在腦組織缺血再灌注損傷[13]、炎症[14]、電離輻射損傷[15]、神經系統損傷以及代謝綜合徵[16-17]等疾病中均發揮一定的作用。

近年來，通過採用增加壓強等技術將氫氣溶解於水中，製備獲得了給予方便且安全的富氫水，推動了氫在臨床研究中的應用。研究發現富氫水可減輕組織氧化應激和炎症反應[18-19]。另有少量研究表明，富氫水對腎癌[8]及非酒精性脂肪肝引發的肝癌具有一定的預防作用[20]。本研究利用結腸癌荷瘤小鼠動物模型，研究了富氫水對結腸癌腫瘤細胞增殖、凋亡及氧化應激狀態的影響，結果表明富氫水可有效抑制腫瘤細胞的增殖，抑制腫瘤的生長，誘導腫瘤細胞凋亡，並進一步證明了富氫水抗腫瘤生物學活性的發揮與其對腫瘤組織氧化應激狀態的調節作用有關。

機體尤其是線粒體產生的ROS在各種細胞信號轉導中扮演重要角色。一方面，危險因素如吸菸、環境污染物、輻射、病毒感染等可通過誘導產生大量ROS引發慢性病如惡性腫瘤的發生；另一方面ROS可通過激活NF-κB、AP-1(activator protein-1)等轉錄因子，調控炎症反應以及腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移及血管生成等。ROS還可調控抑癌基因如p53、PTEN及Rb基因的表達；然而腫瘤的放、化療又是通過產生大量ROS發揮殺傷腫瘤細胞的作用，另外一些功能性抗腫瘤活性物質又通過清除ROS減輕氧化應激狀態，以發揮預防腫瘤的活性。這提示ROS的功能類似於TNF-α、炎症反應及NF-κB，具有「抑癌」及「促癌」的「雙刃劍」效應，提示機體氧化應激狀態的調控在腫瘤治療中可能具有重要的作用[21]。已有研究表明GSH的損耗對細胞氧化應激平衡的調節及細胞死亡通路的激活發揮重要的中樞調控作用[22]，本研究發現富氫水干預後，雖然並未降低結腸癌組織細胞內ROS的含量，但可降低GSH水平、升高GSSG水平，提高GSSG/GSH的比值，從而打破細胞內的氧化還原平衡，使腫瘤組織處於ROS應激狀態，這可能是富氫水發揮抗腫瘤活性的機制之一。

為了進一步探究富氫水抑制腫瘤細胞增殖、促進其凋亡的分子機制，本研究還利用基因晶片對比研究了富氫水干預組與對照組的差異表達基因，發現富氫水干預後可影響γ-干擾素相關基因的表達。干擾素是一類重要的抗病毒、抗腫瘤和免疫調節細胞因子，廣泛用於造血系統惡性腫瘤、淋巴瘤及多種實體瘤的臨床治療。研究表明干擾素與細胞表面受體結合後，主要通過JAK/STAT信號途徑，調節如凋亡相關分子Fas/FasL、TRAIL/APO-2、抑癌基因bax、bak及p53等一系列干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的表達，這些ISGs與細胞凋亡及細胞周期密切相關[23]。此外，干擾素還可放大由caspase誘導的線粒體功能紊亂效應，誘導線粒體途徑的細胞凋亡。因而，干擾素可通過調節細胞周期、抑癌基因的表達及增強腫瘤細胞對凋亡信號的敏感性，誘導腫瘤細胞凋亡，發揮其抗腫瘤生物學活性。本研究結果表明富氫水干預可上調Mmp9、II12rb1、Csf2rb、Tnfaip812、Cxcl9，下調Cdk6、Nrp2及Cldn24等γ-干擾素相關基因的表達(P < 0.05)，其中Mmp9基因參與腫瘤的轉移及血管生成[24]；Csf2rb基因參與JAK/STAT信號通路、調控細胞凋亡等[25]；Cxcl9基因參與Notch信號通路，從而參與調控細胞凋亡及細胞周期[26]；Nrp2基因不僅與血管生成相關，還可調控細胞增殖、細胞周期、細胞運動和細胞遷移、細胞分化、細胞凋亡等[27]。上述研究結果提示富氫水可能通過影響多個靶基因發揮腫瘤的抑制作用，對上述基因的具體調控機制和途徑尚需要進一步研究。